Fluorescence in situ hybridization

Fluorescence in situ hybridization (FISH)
Slides used for chromosome number analysis were re-fixed in a mixture of 99.9 % Et-OH : glacial acetic acid (3:1) for 2–3 min to remove the DAPI, rinsed with 99.9 % ethanol,air dried and used for FISH experiments. Slides were incubated in 100 lg/mL RNase in 2xSSC for 1 h at 37 C and rinsed three times in 2 9 SSC at room temperature for 5 min. They were then incubated in 10 mM HCl for 5 min at room temperature, treated with an 0.01 mg/ml pepsin solution for 15 min at 37 C and washed in 2 9 SSC.Subsequently, the slides were fixed in 1 % formaldehyde in 1 9 PBS for 10 min and again rinsed three times in 2 9 SSC for 5 min; then dehydrated in 70, 90 and 100 %
ethanol and air dried. The hybridization mixture containing 1 ng/lL of each DNA probe, 50 % formamide, 10 % dextran sulphate, 0.5 % sodium dodecyl sulphate and 2xSSC was pre-denatured at 75 C for 10 min and stabilised on ice for 10 min. A 38 lL aliquot of the hybridization mixture was applied to the chromosome preparations, covered with a plastic coverslip and denatured
together at 75 C for 5 min in an Omnislide Thermal Cycler. Hybridization was carried out at 37 C in a humid chamber for 24 h. Stringent washing of slides at 42 C involved 2 9 SSC for 5 min, two changes of 20 % formamide in 0.1 9 SSC for 5 min and three changes of 2 9 SSC for 3 min. The Coplin jar was cooled to room temperature and slides were rinsed in 2 9 SSC and 4 9 SSC/Tween 20. In the case of the digoxygenin-labelled probe, 180 lL of a 5 % milk-blocking reagent was
applied to each slide and incubated in a humid chamber at room temperature for 30 min, then 45 lL of fluorescein (FITC) conjugated anti-digoxigenin Fab fragments (Roche), at a concentration 1:11 in the 5 % milk-blocking reagent was added. The slides were then incubated at 37 C for 1 h. After incubation, slides were washed in three changes of 4 9 SSC/Tween 20 at 37 C, dehydrated and air dried. A Vectashield mounting medium containing 2.5 lg/mL DAPI was applied to the dry slides before adding coverslips. Slides were analyzed with the use of an epifluorescence microscope (OLYMPUS) with the appropriate filters. Pictures were taken with a CCD camera and
processed with Adobe Photoshop software using only the functions that are applied equally to all pixels of the image.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เรืองแสงในแหล่งกำเนิด hybridization (ปลา)ภาพนิ่งที่ใช้สำหรับวิเคราะห์จำนวนโครโมโซมที่ถาวรอีกครั้งของ 99.9% ร้อยเอ็ด-OH: กรดอะซิติกน้ำแข็ง (3:1) 2 – 3 นาทีเพื่อเอา DAPI ล้าง ด้วยเอทานอล 99.9% อากาศแห้ง และใช้สำหรับการทดลองปลา ภาพนิ่งที่ได้รับการกกใน 100 lg/mL RNase ใน 2xSSC สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 37 C และล้าง 3 ครั้งใน 2 9 SSC ที่อุณหภูมิห้อง 5 นาที พวกเขานั้นได้รับการกกใน 10 มม. HCl 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง รักษา ด้วยโซลูชั่นเพพซิน 0.01 mg/ml สำหรับ 15 นาทีที่ 37 C และล้างใน 2 9 SSC ต่อมา ภาพนิ่งถูกแก้ไขในฟอร์มาลดีไฮด์ 1% ใน 1 9 PBS 10 นาทีและ 9 2 กลั้วอีกสามครั้งใน SSC สำหรับ 5 นาที แล้ว อบแห้ง 70, 90 และ 100%เอทานอลและอากาศแห้ง ผสม hybridization ประกอบด้วย 1 ฉบับ/lL ของแต่ละดีเอ็นเอโพรบ formamide 50%, 10% เดกซ์แทรนซัลเฟต 0.5% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต และ 2xSSC ถูก denatured ก่อน 75 c เป็นเวลา 10 นาที และมีน้ำแข็งสำหรับ 10 นาที ส่วนลงตัวจะเป็น 38 ของผสม hybridization กับเตรียมโครโมโซม coverslip พลาสติกคลุม และเอทิลแอลกอฮอล์กันที่ C 75 สำหรับ 5 นาทีในการ Omnislide ความร้อน Cycler Hybridization ดำเนินที่ 37 C ในห้องชื้นสำหรับ 24 h. ซักผ้าเข้มของภาพนิ่งที่ 42 C เกี่ยวข้อง 2 9 SSC สำหรับ 5 นาที สองการเปลี่ยนแปลงของ formamide 20% ใน 0.1 9 SSC สำหรับ 5 นาทีและเปลี่ยนแปลง 3 9 2 SSC 3 นาที ขวด Coplin ความร้อนกับอุณหภูมิห้อง และภาพนิ่งถูกล้างใน 2 9 SSC และ 4 9 20 SSC/แต่ ในกรณีที่การสอบสวนมีป้าย digoxygenin, 180 จะของเอเจนต์บล็อกนม 5% ได้ใช้กับแต่ละภาพนิ่ง และได้รับการกกในห้องชื้นที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที 45 แล้วจะของ fluorescein (FITC) รวมกันต่อต้าน-digoxigenin Fab เศษ (Roche), 1:11 ความเข้มข้นในสารบล็อกนม 5% เพิ่ม ภาพนิ่งถูกแล้วได้รับการกกที่ 37 C สำหรับ 1 h หลังจากบ่ม ภาพนิ่งถูกล้างในการเปลี่ยนแปลง 3 9 4 20 SSC/แต่ ที่ 37 C แห้งและอากาศแห้ง ใช้สื่อการติดตั้ง Vectashield ประกอบด้วย 2.5 lg/mL DAPI สไลด์แห้งก่อนที่จะเพิ่ม coverslips ภาพนิ่งถูกวิเคราะห์ ด้วยการใช้กล้องจุลทรรศน์การ epifluorescence (OLYMPUS) มีตัวกรองที่เหมาะสม ถ่ายรูป ด้วยกล้อง CCD และประมวลผลกับ Adobe Photoshop ซอฟต์แวร์ที่ใช้ฟังก์ชันที่ใช้เท่ากับทุกพิกเซลของรูปภาพ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เรืองแสงในแหล่งกำเนิดพันธุ์ (FISH)
สไลด์ใช้ในการวิเคราะห์จำนวนโครโมโซมเป็นอีกครั้งที่ได้รับการแก้ไขในส่วนผสมของ 99.9% et-OH: กรดอะซิติกน้ำแข็ง (3: 1) สำหรับ 2-3 นาทีเพื่อลบ DAPI ล้างด้วย 99.9% เอทานอล อากาศแห้งและนำมาใช้สำหรับการทดลองปลา สไลด์ถูกบ่มใน 100 LG / mL RNase ใน 2xSSC เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและล้างสามครั้งใน 2 9 เอสเอสที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที พวกเขาถูกบ่มแล้วใน 10 มิลลิ HCl เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องได้รับการรักษาด้วยวิธีการแก้ปัญหาน้ำย่อย 0.01 mg / ml เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียสและล้างใน 2 9 SSC.Subsequently ภาพนิ่งที่ถูกแก้ไขใน 1% ดีไฮด์ใน 1 9 พีบีเอสเป็นเวลา 10 นาทีและล้างอีกสามครั้งใน 2 9 เอสเอสเป็นเวลา 5 นาที; แล้วคายน้ำใน 70, 90 และ 100%
เอทานอลและอากาศแห้ง ส่วนผสมที่มีการผสมข้ามพันธุ์ 1 ng / LL ของแต่ละสอบสวนดีเอ็นเอ formamide 50%, 10% ซัลเฟต dextran, 0.5% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตและ 2xSSC ถูกก่อนเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 75 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและมีความเสถียรบนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที หาร 38 LL ผสมผสมพันธุ์ที่ถูกนำไปใช้กับการเตรียมโครโมโซมปกคลุมด้วย coverslip พลาสติกและเอทิลแอลกอฮอล์
กันที่ 75 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีในการระบายความร้อน Cycler Omnislide การผสมพันธุ์ได้ดำเนินการที่ 37 องศาเซลเซียสในห้องชื้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซักผ้าที่เข้มงวดของภาพนิ่งที่ 42 องศาเซลเซียสส่วนเกี่ยวข้อง 2 9 เอสเอสเป็นเวลา 5 นาที, สองการเปลี่ยนแปลงจาก 20% ใน formamide 0.1 9 SSC เป็นเวลา 5 นาทีและสามการเปลี่ยนแปลง 2 9 เอสเอสเป็นเวลา 3 นาที โถ Coplin ถูกระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องและภาพนิ่งถูกล้างใน 2 9 SSC และ 4 9 SSC / Tween 20. ในกรณีที่มีการสอบสวน digoxygenin ป้ายที่ 180 LL ของ 5% นมปิดกั้นสารที่ถูก
นำไปใช้กับแต่ละภาพนิ่งและ บ่มในห้องชื้นที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีแล้ว 45 LL ของ fluorescein (FITC) ผันป้องกัน digoxigenin เศษ Fab (Roche) ที่มีความเข้มข้น 01:11 ใน 5% นมปิดกั้นสารถูกเพิ่มเข้ามา สไลด์ถูกบ่มแล้วที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการบ่มภาพนิ่งถูกล้างในสามการเปลี่ยนแปลง 4 9 SSC / Tween 20 ที่ 37? C, แห้งและอากาศแห้ง กลางติดตั้ง Vectashield มี 2.5 LG / mL DAPI ถูกนำไปใช้กับภาพนิ่งแห้งก่อนที่จะเพิ่ม coverslips สไลด์นำมาวิเคราะห์ด้วยการใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (OLYMPUS) ที่มีฟิลเตอร์ที่เหมาะสม ภาพที่ถูกถ่ายด้วยกล้อง CCD และ
การประมวลผลด้วยโปรแกรม Adobe Photoshop โดยใช้เพียงฟังก์ชั่นที่ถูกนำมาใช้อย่างเท่าเทียมกันในทุกพิกเซลของภาพ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เรืองแสงใน situ hybridization ( FISH )สไลด์ที่ใช้ในการวิเคราะห์จำนวนโครโมโซมเป็นอีกครั้งที่ถาวรในส่วนผสมของ 99.9% และโอ : กรดแอซีติก ( 3 : 1 ) 2 – 3 นาที เอา dapi 99.9% , ล้างด้วยแอลกอฮอล์ อากาศแห้ง และใช้ในการทดลองของปลา ภาพนิ่งที่ถูกบ่มใน 100 LG / ml เลสใน 2xssc เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และล้าง 3 ครั้ง ใน 2 9 SSC ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นบ่มใน HCl 10 มม. สำหรับ 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ถือว่าเป็น 0.01 mg / ml เอนไซม์เปปซินโซลูชั่นสำหรับ 15 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส และล้างใน 2 9 SSC ภายหลัง สไลด์เป็นคงที่ 1% ฟอร์มาลดีไฮด์ใน 1 9 พีบีเอส 10 นาทีและอีกครั้งล้าง 3 ครั้งใน 2 9 SSC เป็นเวลา 5 นาที แล้วอบแห้งใน 70 , 90 และ 100 เปอร์เซ็นต์เอทานอล และอากาศแห้ง สารผสมที่ประกอบด้วย 1 ng / จะแต่ละ DNA probe 50% Formamide 10% dextran ซัลเฟต 0.5 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต และ 2xssc คือก่อนเกิดที่ 75 C เป็นเวลา 10 นาทีและมีความเสถียรในน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที 38 จะเป็นส่วนลงตัวของเบสผสมมาใช้ในการเตรียมโครโมโซม , ปกคลุมด้วยปิดสไลด์ใช้พลาสติกและด้วยกันที่ 75 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีใน omnislide Thermal cycler . ดำเนินการที่อุณหภูมิ 37 องศาภายในห้องชื้นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อล้างสไลด์ที่เกี่ยวข้อง 2 9 SSC 42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที สองการเปลี่ยนแปลงของ 20% Formamide 0.1 9 SSC เป็นเวลา 5 นาทีและสามการเปลี่ยนแปลง 2 9 SSC 3 นาที coplin ขวดมันเย็นที่อุณหภูมิห้อง และภาพนิ่งที่ถูกล้าง 2 9 4 9 SSC SSC / Tween 20 ในกรณีของ digoxygenin labelled Probe 180 จะเป็น 5 % นมกั้นสารเคมีคือใช้กับภาพนิ่งแต่ละบ่มในห้องชื้นที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น 45 จะี่ ( fitc ) และป้องกันเศษติดส์ ( โรช ) ที่ความเข้มข้น 1 : 11 ใน 5 % นมกั้นสารเคมีที่ถูกเพิ่มเข้ามา สไลด์แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสนาน 1 ชั่วโมงหลังจากการบ่ม ภาพนิ่งได้ซักสามการเปลี่ยนแปลง 4 9 SSC / Tween 20 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส อบแห้ง และอากาศแห้ง เป็นอาหารที่มี vectashield ติดตั้ง 2.5 LG / ml dapi ใช้ภาพนิ่งแห้งก่อนที่จะเพิ่ม coverslips . ภาพนิ่ง วิเคราะห์ข้อมูลด้วยการใช้เป็น epifluorescence กล้องจุลทรรศน์ ( Olympus ) กับตัวกรองที่เหมาะสม ภาพที่ถูกถ่ายด้วยกล้อง CCD และประมวลผลด้วยโปรแกรม Adobe Photoshop ที่ใช้เฉพาะฟังก์ชันที่ใช้อย่างเท่าเทียมกันทุกพิกเซลของภาพ