Ethylene production from petals and

Ethylene production from petals and gynoecium was deter-mined as described by Ichimura et al. (2009). For the extractionof ACC, ACC synthase and ACC oxidase, petals (0.5 g) obtained fromthree flowers were extracted as described by Ichimura et al. (2009).ACC concentration was determined by the method of Lizada andYang (1979). ACC synthase activity was measured by incubatinga standard reaction mixture containing 0.4 mL of enzyme prepa-ration, and 0.1 mL each of 4 mM HEPES-KOH (pH 8.5), 0.3 mMS-adenosylmethionine (Sigma-Aldrich) and 0.4 M pyridoxal 5-phosphate (Sigma-Aldrich) at 30◦C for 30 min and stopping thereaction by the addition of 0.1 mL of 20 mM HgCl2. ACC was assayedaccording to Lizada and Yang (1979), and ACC oxidase activity wasmeasured as described by Ichimura et al. (2009).To determine DcACS1 and DcACO1 transcript levels, petals werecollected from three individual flowers. Total RNA was isolatedfrom six petals using ISOGEN (Nippongene, Toyama, Japan), treatedwith an RNase-free DNase set (Qiagen, Hilden, Germany) to digestgenomic DNA, and purified using an RNeasy mini kit (Qiagen). Syn-thesis of cDNA was carried out with random hexamer primers usingthe SuperScript first-strand synthesis system for RT-PCR (Invitro-gen, Carlsbad, CA, USA). Preparation of the primer pairs and PCRreactions were performed as described in Tanase et al. (2008). Thefollowing thermalcycler program was applied: initial polymeraseactivation at 95◦C for 10 min; then for DcACT1-2, a constitutivelyexpressed control gene, 30 cycles of 94◦C for 10 s, 60◦C for 10 s,72◦C for 15 s; for DcACS1, 50 cycles of 94◦C for 10 s, 55◦C for 15s, 72◦C for 20 s; and for DcACO1, 40 cycles of 94◦C for 10 s, 60◦Cfor 10 s, 72◦C for 15 s. Transcript levels of the target genes werenormalized to the transcript levels of DcACT1-2 and reported as rel-ative transcript level based on the method of Shibuya and Ichimura(2010).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เอทิลีนผลิตจากกลีบและ gynoecium ถูกขัดขวางขุดตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura et al. (2009) Extractionof บัญชี synthase บัญชี และบัญชี oxidase กลีบ (0.5 กรัม) รับดอกไม้ fromthree ถูกขยายตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura et al. (2009)เข้มข้นบัญชีถูกกำหนด โดยวิธีการของ Lizada andYang (1979) กิจกรรมบัญชี synthase ถูกวัด โดยผสมปฏิกิริยามาตรฐาน incubatinga ประกอบด้วย 0.4 mL ของเอนไซม์ prepa-อาหาร และ 0.1 mL ละ 4 มม. HEPES-เกาะ (ค่า pH 8.5), mMS-adenosylmethionine (ซิก-Aldrich) 0.3 และ 0.4 M pyridoxal 5-ฟอสเฟต (Aldrich ซิกมา) ที่ 30 นาทีและหยุด thereaction ด้านนอก 0.1 mL ของ 20 mM HgCl2 การบัญชี 30◦C เป็น assayedaccording Lizada และยาง (1979)และบัญชี oxidase กิจกรรม wasmeasured ตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura et al. (2009)การกำหนด DcACS1 และ DcACO1 เสียงบรรยายระดับ werecollected กลีบจากดอกไม้สามละ อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูก isolatedfrom หกกลีบใช้ ISOGEN (Nippongene โทยามะ ญี่ปุ่น), treatedwith เป็นฟรี RNase DNase กำหนด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) digestgenomic ดีเอ็นเอ และบริสุทธิ์ที่ใช้เป็นชุดมินิ RNeasy (Qiagen) Syn-วิทยานิพนธ์ของ cDNA ถูกดำเนินการ ด้วย usingthe ไพรเมอร์ hexamer สุ่มระบบสังเคราะห์สาระแรกตัวยกสำหรับ RT-PCR (Invitro gen คาร์ลส CA, USA) การเตรียมการของรองพื้นคู่กับ PCRreactions ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน Tanase et al. (2008) ใช้โปรแกรม thermalcycler Thefollowing: polymeraseactivation เริ่มต้นที่ 95◦C สำหรับ 10 นาที แล้วสำหรับ DcACT1-2 การ constitutivelyexpressed ตัวควบคุมยีน รอบ 30 ของ 94◦C 10 s, 60◦C 10 s, 72◦C 15 s สำหรับ DcACS1, 50 รอบของ 94◦C s, 55◦C สำหรับ 15s, 72◦C สำหรับ 20 10 s และ สำหรับ DcACO1, 94◦C รอบ 40 10 s, 60◦Cfor s, 72◦C เสียงบรรยาย s ได้ 15 ระดับของ werenormalized ยีนเป้าหมายระดับเสียงบรรยาย DcACT1 2 10 และรายงานระดับเสียงบรรยาย rel ative ตามวิธีของชิบูย่าและ Ichimura(2010)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การผลิตเอทิลีนจากกลีบและ gynoecium ถูกยับยั้ง-ศีลธรรมตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura และคณะ (2009) สำหรับแม็ก extractionof, เทส ACC และ ACC oxidase กลีบ (0.5 กรัม) ที่ได้รับดอกไม้ fromthree ถูกสกัดตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura และคณะ (2009) ความเข้มข้น .ACC ถูกกำหนดโดยวิธีการ Lizada andYang (1979) กิจกรรมเทสแม็กโดยวัดจากผสมปฏิกิริยา incubatinga มาตรฐานที่มี 0.4 มิลลิลิตรของเอนไซม์ prepa-ปันส่วนและ 0.1 มิลลิลิตรแต่ละ 4 มม HEPES-KOH (pH 8.5) 0.3 MMS-adenosylmethionine (Sigma-Aldrich) และ 0.4? M pyridoxal 5- ฟอสเฟต (Sigma-Aldrich) ที่30◦Cเวลา 30 นาทีและหยุด thereaction โดยนอกเหนือจาก 0.1 มิลลิลิตร 20 มิลลิเมตร HgCl2 แม็กถูก assayedaccording เพื่อ Lizada และหยาง (1979) และ ACC oxidase wasmeasured กิจกรรมตามที่อธิบายไว้โดย Ichimura และคณะ (2009) หากต้องการตรวจสอบ DcACS1 และ DcACO1 ระดับหลักฐานกลีบ werecollected จากสามดอกไม้แต่ละบุคคล รวม RNA เป็น isolatedfrom หกกลีบใช้ Isogen (Nippongene ยะ, ญี่ปุ่น), treatedwith ชุด DNase RNase ฟรี (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) กับดีเอ็นเอ digestgenomic และบริสุทธิ์โดยใช้ชุดมินิ RNeasy (Qiagen) Syn-วิทยานิพนธ์ของยีนได้ดำเนินการกับไพร hexamer สุ่ม usingthe ยกระบบเส้นใยสังเคราะห์แรกสำหรับ RT-PCR (Invitro-Gen, คาร์ลส, CA, USA) การเตรียมความพร้อมของคู่ไพรเมอร์และ PCRreactions ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน Tanase และคณะ (2008) thefollowing โปรแกรม thermalcycler ถูกนำไปใช้: polymeraseactivati​​on เริ่มต้นที่95◦Cเวลา 10 นาที; แล้วสำหรับ DcACT1-2, ยีนควบคุม constitutivelyexpressed 30 รอบของ94◦C 10 วินาที, 60◦C 10 วินาที, 72◦Cสำหรับ 15 วินาที; สำหรับ DcACS1, 50 รอบของ94◦C 10 วินาที, 55◦Cสำหรับ 15s, 72◦C 20 วินาที และ DcACO1 40 รอบของ94◦C 10 วินาที, 60◦Cfor 10 วินาที, 72◦Cสำหรับ 15 วินาที ระดับสำเนาของยีนเป้าหมาย werenormalized ในระดับที่บันทึกของ DcACT1-2 และรายงานเป็นระดับหลักฐาน rel-Ative ขึ้นอยู่กับวิธีการของ Shibuya และ Ichimura (2010)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การผลิตเอทิลีนจากกลีบ จินนีเซียมถูกยับยั้งไว้ ตามที่อธิบายไว้โดย ichimura et al . ( 2009 ) สำหรับ extractionof บัญชี และบัญชีและ ACC oxidase , กลีบ ( 0.5 กรัม ) ได้ 3 ดอกสกัด ตามที่อธิบายไว้โดย ichimura et al . ( 2009 ) บัญชี สมาธิถูกกำหนดโดยวิธีการของ lizada andyang ( 1979 )กิจกรรม และ บัญชีวัดด้วยมาตรฐาน incubatinga ปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย 0.4 มิลลิลิตรเอนไซม์เตรียมความพร้อมสําหรับวันหยุดและเลือกอาหารและ 0.1 มิลลิลิตร แต่ละ hepes-koh 4 มม. ( pH 8.5 ) , 0.3 MMS adenosylmethionine ( ซิกม่า Aldrich ) และ 0.4  M pyridoxal 5-phosphate ( ซิกม่า Aldrich ) ที่ 30 ◦ C นาน 30 นาทีและหยุดปฏิกิริยาโดยการเพิ่ม 0.1 มิลลิลิตร ของ hgcl2 20 มิล บัญชีเป็น assayedaccording เพื่อ lizada และหยาง ( 1979 )และกิจกรรมของเอนไซม์ ACC วัดตามที่อธิบายไว้โดย ichimura et al . ( 2009 ) เพื่อตรวจสอบ dcacs1 และระดับผลการเรียน dcaco1 เก็บจากสามดอก กลีบดอก แต่ละบุคคล อาร์เอ็นเอรวมจาก 6 กลีบ ใช้ isogen ( nippongene , โทยามะ , ญี่ปุ่น ) , treatedwith เป็นเลสฟรีตรวจหา ADNase ชุด ( เพิ่ม Hilden , เยอรมนี ) digestgenomic ดีเอ็นเอ และบริสุทธิ์ใช้ชุดมินิ rneasy ( เพิ่ม )* วิทยานิพนธ์ cDNA ถูกตรวจสอบ ด้วยไพรเมอร์แบบสุ่มโดยใช้ลวดหนามก่อนเกลียวเฮกเซอเมอร์สังเคราะห์ระบบนี้ ( คือมี , Carlsbad , CA , USA ) การเตรียมการของไพรเมอร์คู่และ pcrreactions มีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ในรูปแบบ et al . ( 2008 ) คือโปรแกรมที่ใช้ polymeraseactivation เทอร์มอล ไซเคล ์ : เริ่มต้นที่ 95 ◦ C นาน 10 นาที แล้ว dcact1-2 สำหรับ ,เป็น constitutivelyexpressed ควบคุมยีน 30 รอบ 94 ◦ C 10 , 60 ◦ C 10 , 72 ◦ C เป็นเวลา 15 วินาที สำหรับ dcacs1 50 รอบ 94 ◦ C 10 S 55 C ◦ 15s , 72 ◦ C 20 s ; และ dcaco1 94 ◦ 40 รอบ นาน 10 วินาที , 60 ◦ C เป็นเวลา 10 , 72 ◦ C เป็นเวลา 15 วินาทีระดับสำเนาของยีนเป้าหมาย werenormalized เพื่อบันทึก และรายงาน เป็นระดับ dcact1-2 rel แสดงความโน้มเอียงหรืออารมณ์ผลการเรียนระดับตามวิธีของชิบุย่า และ ichimura ( 2010 )