Since white adipose tissue extracts showed a very high malic enzyme activity as measured by
NADPH formation, it was important at the outset to be certain that this was indeed due to
malic enzyme activity. The reaction was therefore run in the reverse direction, and concomitant
measurements were made of NADPH oxidation and CO2 fixation. The supernatant of adipose
tissue homogenates obtained in the manner described for the routine assay procedure was passed
through Sephadex G-25 in the cold. An aliquot of this material was then added to a cuvette
which could be stoppered and which contained: tris buffer pH 7.4, 40 mM; sodium pyruvate, 14
mM; NADPH, 2 mM; and MgCl2, 5 mM. A small blank rate of oxidation of NADPH was then
measured by following absorbancy changes at 340 mgu (presumably due to lactate dehydrogenase
activity). There was then added 0.4 ml of 0.5 M KHCO3 (previously saturated with CO2 gas)
and 0.05 ml of NaHC1403 (12.5 ,umoles). The cuvette was immediately stoppered. The total
fluid volume in the cuvette was then 3.85 ml. The absorbancy changes at 340 mgA were then
followed for 18 min at 37°. The reaction was then stopped by the addition of 0.2 ml 30% HCl04.
The protein precipitate was centrifuged down, the supernatant removed, and CO2 bubbled through
it for 15 min. The solution was neutralized, and aliquots were plated on aluminum planchets and
counted in a windowless flow counter. Expressed in terms of mg N in the original tissue homogenate
the rate of NADPH oxidation was 36 and fixation of CO2 was 32 ,umoles per hour. These
values agree well with those obtained by measurement of NADPH formation (cf. Table 1, Group
I). If no NADPH was added or NADH added in place of NADPH, the rate of CO2 fixation was
less than 1.5 ,umoles per mg N per hr. When NADH was used, a very rapid oxidation of this reduced
coenzyme occurred due to its reaction in the lactate dehydrogenase system, and so the
reaction in this case was stopped at the end of 6 min.
เนื่องจากสารสกัดจากเปลวสีขาวแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมเอนไซม์ malic สูงวัดจาก
NADPH ก่อ มันเป็นสิ่งสำคัญที่มือเพื่อให้แน่ใจว่า นี้เป็นจริงเนื่อง
เอนไซม์ malic ดังนั้นรันปฏิกิริยาในทิศทางย้อนกลับ และ concomitant
ทำวัด NADPH ออกซิเดชันและปฏิกิริยาการตรึง CO2 Supernatant ของ adipose
homogenates เนื้อเยื่อได้รับในลักษณะอธิบายไว้สำหรับส่งขั้นตอนการทดสอบประจำ
ผ่าน Sephadex G-25 ในเย็นนั้น เป็นส่วนลงตัวของวัสดุนี้ถูกเพิ่มไป cuvette
ที่สามารถ stoppered และที่อยู่: ทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ pH 7.4, 40 มม. โซเดียม pyruvate, 14
mM NADPH, 2 มม. และ MgCl2, 5 มม. อัตราว่างขนาดเล็กของการเกิดออกซิเดชันของ NADPH ถูกแล้ว
วัดตามการเปลี่ยนแปลง absorbancy ที่ 340 mgu (สันนิษฐานจาก lactate dehydrogenase
กิจกรรม) มีแล้วเพิ่ม 0.4 ml 0.5 M KHCO3 (ก่อนหน้านี้อิ่มตัว ด้วยก๊าซ CO2)
และ 0.05 ml ของ NaHC1403 (12.5, umoles) ทันทีที่ stoppered cuvette รวม
แล้วมีปริมาตรของเหลวใน cuvette 3.85 ml มีการเปลี่ยนแปลง absorbancy ที่ 340 mgA แล้ว
ติดตาม 18 นาทีที่ 37° แล้วหยุดปฏิกิริยา โดยการเพิ่ม 0.2 ml 30% HCl04.
precipitate โปรตีนถูก centrifuged ลง supernatant ออก และ CO2 เป็นฟองผ่าน
มันสำหรับ 15 นาที โซลูชันมี neutralized และ aliquots ถูกชุบบนอลูมิเนียม planchets และ
นับเคาน์เตอร์กระแสไม่มีหน้าต่าง แสดงในรูปของมิลลิกรัม N ใน homogenate เนื้อเยื่อเดิม
อัตราการเกิดออกซิเดชัน NADPH 36 และปฏิกิริยาการตรึง CO2 ได้ 32, umoles ต่อชั่วโมง เหล่านี้
ค่าตกลงกับผู้รับ โดยวัด NADPH ก่อ (cf. ตารางที่ 1 กลุ่ม
ฉัน) ถ้าไม่มี NADPH เพิ่ม หรือ NADH เพิ่มแทน NADPH อัตราของปฏิกิริยาการตรึง CO2 ได้
umoles น้อยกว่า 1.5 ต่อมิลลิกรัม N ต่อชั่วโมง เมื่อใช้ NADH ออกซิเดชันอย่างรวดเร็วมากนี้ลด
coenzyme เกิดจากปฏิกิริยาของระบบ lactate dehydrogenase และเพื่อ
ปฏิกิริยาในกรณีนี้ถูกหยุดท้ายนาที 6
การแปล กรุณารอสักครู่..